автор Воложин Григорий Александрович

ОСТЕОГЕННЫЕ ПОТЕНЦИИ НЕДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫХ КЛЕТОК ПАРОДОНТАЛЬНЫХ ТКАНЕЙ in vitro 

В эксперименте in vitro были оценены способность к пролиферации и остеогенной дифференцировке мезенхимальных стромальных клеток (МСК) из надкостницы альвеолярного отростка, оболочки Гертвига (окружающей третьи моляры с несформированными корнями) и биоптатов губчатой костной ткани. Констатируется, что все три источника МСК перспективны  для использования в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии.

Capacity to proliferation and osteogenic differentiation of pluripotent mesenchymal cells of alveolar process periosteum, periodontal ligament and specimens of cancellous bone tissue was estimated during in vitro experiment. It has been concluded that all this types of cells are promising sources for application in maxillofacial and oral surgery.

 

В стоматологии и челюстно-лицевой хирургии для возмещения костных дефектов все большее распространение находят технологии с использованием полученных от взрослых людей прогениторных клеток различной степени зрелости. Наиболее частыми источниками их выделения являются костный мозг и подкожная жировая ткань, что связано с дополнительной хирургической инвазией для пациента. Между тем, при санации ротовой полости в плане подготовки к операции по возмещению костного дефекта челюстей нередко возникает необходимость в удалении одного-двух и более зубов. При этом открывается доступ для получения материала, содержащего клетки-предшественники остеогенеза – биоптатов губчатой кости (БГК), оболочки Гертвига (ОГ) и надкостницы альвеолярного отростка (НК), которые после выделения и размножения in vitro могут быть использованы для приготовления аутографтов. В настоящем сообщении приводятся предварительные результаты цитологических исследований, обосновывающие такую возможность. 

 

Материалы и методы

Материал для цитологических исследований был получен от 25 пациентов в виде небольших фрагментов БГК (n=12, возрастной диапазон 17-61 год), НК (n=10, 19-29 лет), либо ОГ (n=3, 17-26 лет). Получение биоптатов губчатой кости производилось костными кусачками из области бугра верхней челюсти сразу же после удаления верхних зубов мудрости, фрагмент надкостницы размером 1 см² иссекался при удалении третьих нижних моляров со стороны наружной поверхности тела нижней челюсти, оболочка Гертвига извлекалась острым способом из лунки удаленного зуба мудрости. Таким образом, взятие всех образцов тканей осуществлялось без проведения дополнительной хирургической процедуры, не усугубляя тяжесть операционной травмы.  

Образцы тканей с соблюдением асептики переносили в  пробирки («Corning», США) с кондиционной  средой  (5 мл), состоящей: среды DMEM с высоким содержанием глюкозы (4,5 г/л) («ПанЭко», РФ), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС)  («HyClon», США) и 200 ед/мл гентамицина.  Пробирки с клетками центрифугировали при 200 g в течение 10 мин при 4^ºС, супернатант отбрасывали, а образцы переносили в новые стерильные пробирки и заливали новой порцией среды с высоким содержанием антибиотика. Пробирки энергично покачивали, достигая промывания образцов стерильной средой, затем снова центрифугировали. Эту операцию по промыву и смене пробирок повторяли не менее 5 раз. После последнего центрифугирования образцы  стерильно переносили в чашки Петри («Corning», США) диаметром 3 см и заливали 1 мл среды. Далее с помощью стерильных ножниц или стерильных щипцов  в ламинарном  шкафу  (Babcock TVG 1.14.1S, ФРГ) образцы измельчали до размера не более 1-2 мм. Среду удаляли и заливали образцы средой того же состава, но добавлением  коллагеназы 1 типа (Sigma, США) 1 мг/мл. Инкубировали при 37^ºС в течение 30 мин. После этого фрагменты  переносили в коническую пробирку, куда доливали 10 мл среды DMEM ЭТС, центрифугировали в течение 10 мин при 800 g при 4^ºС. Супернатант отбрасывали, осадок снова ресуспендировали в 10 мл среды с сывороткой, проводили повторное центрифугирование, после чего осадок ресуспендировали в 5 мл ростовой среды описанного состава с добавлением 10 нг/мл человеческого рекомбинантного основного фактора роста фибробластов (ФРФ_о) (CellGenix, Германия) и помещали в культуральный флакон площадью 25 см² («Corning», США), который инкубировали при 37^ºС в атмосфере с 5% углекислого газа в термостате (Sanyo MCO-15AC, Япония). Среду во флаконе меняли каждые 3-4 дня. По достижении клетками монослоя их пересевали используя трипсин («ПанЭко», РФ) или смесь трипсин/Версен («ПанЭко», РФ) по обычной схеме.

После 4 пассажей клетки подвергали криоконсервации: за сутки до нее заменяли культуральную среду, с помощью 0,25% раствора трипсина («ПанЭко», РФ) клетки снимали с подложки и переводили в ростовую среду с повышенным содержанием сыворотки (40% эмбриональной телячьей сыворотки («HyClon», США)). Полученную суспензию охлаждали до 4⁰С. Затем при тщательном перемешивании в нее добавляли диметилсульфоксид (Sigma, для замораживания клеток, США) до 10% общего объема. Полученную суспензию, содержащую примерно 1 млн клеток в мл, разливали по 1 мл в пробирки для криоконсервирования (Nunclon, Дания). Пробирки запаковывали в пенопластовые пеналы и на сутки помещали в кельвинатор с температурой -70⁰С. После этого пробирки переносили в специализированный сосуд Дьюара с жидким азотом.

Исходя из происхождения взятых для исследования тканей и способа выделения, полученные клетки обозначали как мезенхимные стромальные (МСК). Клетки из тканей всех 3 типов исследовали на способность к колониеобразованию –  % колоний, содержащих более 16 клеток, при культивировании 100 клеток 4-ого пассажа. Суммарное количество колоний, содержащих более 16 клеток, выраженное в процентах мы называли эффективностью клонирования. Данный анализ, помимо эффективности клонирования позволяет определить средний и максимальный размер колоний

   Способность культивированных клеток к индукции остеогенной дифференцировки определяли после инкубирования в кондиционной среде без ФРФ_о, содержащей 50 мкМ аскорбат-2-фосфата, 10 мМ β-глицерофосфата и 0,1 мкМ дексаметазона   с измерением размеров костных узелков. Оценку активности щелочной фосфатазы (КФ 3.1.3.1) проводили по методу McGadey, а способность экспрессированного матрикса к минерализации – выявлением кальция ализариновым красным.

 Культуры клеток наблюдали с помощью инвертированного фазово-контрастного микроскопа Diavert (Nikon, Япония). Фотографии делали цифровой камерой Nikon D70. Цифровое усиление контраста проводили с помощью программы Image J.

Сравнительный анализ всех культур МСК, полученных из материала БГК, НК и ОГ, проводили с помощью визуального ранжирования по степени выраженности изучаемых признаков: способности образовывать минерализованный матрикс и активности ЩФ. Следует отметить, что процедура ранжирования, безусловно, несет отпечаток субъективности, однако мы полагаем, что другие стандартные способы количественного анализа костеобразования и активности ЩФ имеют более существенные недостатки. При этом определение количества минерализованного матрикса, который выявляется окраской ализариновым красным, с нашей точки зрения является лучшей мерой оценки костеобразования, поскольку включает в себя измерение конечного продукта костной дифференцировки.

Так, при постановке опытов по остеогенной дифференцировке клеток некоторые культуры обладали более слабой способностью формировать костные структуры. В этом случае окрашивание большей части поверхности чашки не происходило. В других же случаях практически вся поверхность окрашивалась довольно интенсивно. Чашка становилась непрозрачной и оптическая плотность культуры не могла быть точно измерена. 

Кроме того, помимо собственно интенсивности окраски имеются и другие параметры, которые несут информацию об остеогенезе. В образцах с наиболее активно протекающим процессом костеобразования даже невооруженным глазом отчетливо видна трехмерная структура костных узелков различного размера, образующаяся на дне чашки. При сравнении любых двух чашек, практически всегда легко сказать какая из них имеет более развитую структуру образовавшегося минерализованного матрикса. Это позволяет внутри каждой группы распределить все чашки по возрастанию костеобразующей способности и составить упорядоченный ряд.

С количественной оценкой активности ЩФ возникли аналогичные трудности. В ряде чашек клетки с очень высокой активностью ЩФ распределены крайне неравномерно (особенно это заметно на образцах МСК, полученных из костного материала), образуя компактные группы, окрашивающиеся практически в черный цвет. В этой ситуации простое измерение оптической плотности по чашке явно будет занижать активность ЩФ. Поэтому, как и в случае с оценкой костеобразовательной активности  проводили ранжирование всех чашек, сравнивая их попарно.

Достоверность различий между группами сравнения определяли с помощью непараметрического критерия U Вилкоксона-Манна-Уитни, составляя общие упорядоченные ряды.

                                  

Результаты и обсуждение

Анализ полученных результатов показал, что в культурах клеток от всех пациентов после индукции остеогенной дифференцировки отчетливо выявлялись как костеобразующая активность МСК, так и активность щелочной фосфатазы. При этом клетки, полученные из БГК, ОГ и НК имели сходные свойства (табл. 1).  В тоже время можно отметить, что культуры МСК, полученных из ОГ, всегда давали интенсивную окраску ализариновым красным, формировали наиболее крупные костные узелки и чаще окрашивались на щелочную фосфатазу. Статистический анализ материала с помощью составления общих упорядоченных рядов подтвердил превышение костеобразующих свойств клеток ОГ над БГК (р_U=0,05) и активности щелочной фосфатазы в культурах клеток ОГ по сравнению с культурами из НК (р_U=0,05). Однако, не найдено различий  в костеобразующих свойствах между МСК из ОГ и НК (р_U>0,05), также как и в активности щелочной фосфатазы между МСК из  ОГ и БГК (р_U>0,05). Учитывая небольшое количество наблюдений в группе ОГ (n = 3), такой результат можно рассматривать лишь как тенденцию к более высокой способности к костеобразованию у клеток из ОГ, по сравнению с БГК и НК. Для вынесения окончательного суждения необходимо продолжение исследований. Сравнение активности костеобразования и окраски на ЩФ между группами культур БГК и НК с использованием непараметрического U-критерия не обнаружило достоверных отличий (р_U>0,05).

Таблица 1

Свойства культур МСК из разных источников

Культуры МСК	Из НК	Из  ОГ	Из БГК
Уверенное (сплошное) костеобразование	7 из 10 культур	3 из 3 культур	7 из 12 культур
Высокая активность ЩФ	5 из 10 культур	3 из 3 культур	5 из 12 культур
Средняя эффективность колониеобразования	55,3 ± 18,2*	37,7 ± 21,7*	27,3 ± 13,9*
Доля позитивных  по ЩФ  клеток	В трех культурах   большинство клеток, в других – от 10 до 50%	30-60% клеток во всех трех культурах	От нескольких процентов до одной трети клеток
Максимальный размер костных узелков	В трех культурах   больше 0,5 мм, в других – немного меньше	Больше или равен 0,5 мм во всех трех культурах	Всегда меньше 0,5 мм

 

В культурах БГК и НК была выявлена сильная положительная корреляция между костеобразующей способностью клеток и активностью ЩФ. То есть в подавляющем большинстве случаев культура с более высокой активностью ЩФ, обладала и более высокой костеобразующей способностью. Различия в уровнях значимости полученных при исследовании культур МСК могут быть связаны с более выраженной гетерогенностью выборки пациентов по полу и возрасту в случае МСК из БГК.

Оценка эффективности колониеобразования МСК показала, что клетки НК по этому показателю статистически достоверно превышают клетки БГК (р_U < 0,01). В то же время статистически значимой корреляции активности костеобразования и эффективности колониеобразования как в случае МСК из НК, так и БГК не выявлено (рис. 5).  Подтверждающим фактом является и то, что при этом тренды внутри соответствующих выборок были разнонаправлены.  

    

         Таким образом, проведенное исследование показало, что в культурах МСК из БГК, НК и ОГ после индукции остеогенной дифференцировки во всех случаях отчетливо прослеживались признаки костеобразования, заключающиеся в формировании минерализованного костного эквивалента. Их выраженность строго коррелировала с активностью щелочной фосфатазы, но не зависела от эффективности колониеобразования клеток. Обнаружена тенденция к более высокой способности к костеобразованию у клеток из ОГ по сравнению с клетками из БГК и НК.  

         Полученные данные доказывают возможность использования взятых при санации ротовой полости биоптатов губчатой кости, надкостницы и оболочки Гертвига  для выделения, криоконсервации и размножения in vitro МСК с сохранением их остеогенного потенциала. В дальнейшем эти клетки могут быть использованы для усиления остеоинтегративных свойств ткане-инженерных конструкций, применяющихся в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии. В настоящее время ясно, что использование для этих целей размноженных in vitro МСК предпочтительнее, чем применение препаратов диспергированного костного мозга, поскольку вызывает более быстрый и равномерно протекающий процесс костеобразования [8,9]. Существенным достоинством предложенных способов получения тканевых образцов является отсутствие для этих целей необходимости в проведении дополнительной хирургической процедуры, что позволяет отнести эту методику к категории малоинвазивных.  

 автор Воложин Григорий Александрович