автор Воложин Григорий Александрович

К ВОПРОСУ О ЗАВИСИМОСТИ ОСТЕОГЕННЫХ ПОТЕНЦИЙ НЕДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫХ КЛЕТОК ИЗ БИОПТАТОВ ГУБЧАТОЙ КОСТИ ЧЕЛЮСТЕЙ ОТ ВОЗРАСТА ДОНОРА 

in vitro оценивали способность к остеогенной дифференцировке мезенхимальных стромальных клеток (МСК), выделенных из биоптатов губчатой кости альвеолярных отростков челюстей людей в возрасте от 17 до 61 года. Подтверждено существование обратной корреляции между костеобразующей активностью клеток и возрастом пациента. В то же  время констатируется, что аутологичные МСК вне зависимости от возраста пациента перспективны для использования в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии.

Capacity to proliferation and osteogenic differentiation of pluripotent mesenchymal cells of specimens of maxilla alveolar cancellous bone tissue of 12 subjects (age ranging from 17 to 61 years) was estimated during in vitro experiment. It has been confirmed existence of inverse correlation between osteogenic capacity of bone cells and age of the patient. Nevertheless it is ascertained, that autogenic pluripotent mesenchymal cells are perspective option of regenerative sources, without dependence from age of the patient.    

 

В настоящее время для ускорения регенерации костных структур все чаще применяются полученные от взрослых людей прогениторные клетки различной степени зрелости [1,2,3]. В стоматологии при санации ротовой полости в ходе подготовки пациента к установке имплантатов или к операции по возмещению костных дефектов челюстей нередко возникает необходимость в удалении одного-двух зубов. При этом открывается доступ для получения биоптатов губчатой кости, содержащих клетки-предшественники остеогенеза. Современные технологии позволяют выделять МСК, размножать их в необходимом количестве in vitro, заселять ими различные материалы и по показаниям имплантировать пациентам такие конструкции с аутологичными клетками. Доказаны способность культивированных клеток переживать процесс имплантации in vivo, а также их дальнейшее участие в регенераторных процессах [4,5]. В то же время не до конца ясным остается вопрос о влиянии возраста донора на остеогенный потенциал выделенных МСК. В экспериментах in vivo было показано [6,7], что конструкции из свежего костного мозга крыс на керамике обладают сниженными остеогенными свойствами, если костный мозг взят от старых животных, даже в случае имплантации этих конструкций молодым животным. В условиях культуры [8] установили не только снижение активности пролиферации стромальных клеток костного мозга, полученных от доноров в возрасте старше 50 лет, но и значительное уменьшение количества случаев, когда вообще наблюдалось костеобразование. Однако, в том же исследовании [8] in vivo при подкожной имплантации мышам клеток от доноров разных возрастных групп, осажденных на пористом носителе из фосфатов кальция, было обнаружено, что клетки всех доноров обладают остеогенным потенциалом.

Основной задачей данной работы было проверить в цитологических исследованиях в культуре наличие зависимости от возраста донора остеогенных свойств МСК, выделенных из биоптатов губчатой кости альвеолярных отростков челюстей людей.

 

Материалы и методы

Материал для цитологических исследований был получен в ходе операций по удалению моляров верхней челюсти от 12 пациентов в возрасте от 17 до 61 года в виде фрагментов губчатой кости размером 1-2 мм³.

Образцы тканей с соблюдением асептики переносили в  пробирки («Corning», США) с кондиционной  средой  (5 мл), состоящей: среды DMEM с высоким содержанием глюкозы (4,5 г/л) («ПанЭко», РФ), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС)  («HyClon», США) и 200 ед/мл гентамицина.  Пробирки с клетками центрифугировали при 200 g в течение 10 мин при 4^ºС, супернатант отбрасывали, а образцы переносили в новые стерильные пробирки и заливали новой порцией среды с высоким содержанием антибиотика. Пробирки энергично покачивали, достигая промывания образцов стерильной средой, затем снова центрифугировали. Эту операцию по промыву и смене пробирок повторяли не менее 5 раз. После последнего центрифугирования образцы  стерильно переносили в чашки Петри («Corning», США) диаметром 3 см и заливали 1 мл среды. Далее в ламинарном  шкафу  (Babcock TVG 1.14.1S, ФРГ) образцы дополнительно измельчали с помощью стерильных ножниц или стерильных щипцов. Среду удаляли и заливали образцы средой того же состава, но добавлением  коллагеназы 1 типа (Sigma, США) 1 мг/мл. Инкубировали при 37^ºС в течение 30 мин. После этого фрагменты  переносили в коническую пробирку, куда доливали 10 мл среды DMEM ЭТС, центрифугировали в течение 10 мин при 800 g при 4^ºС. Супернатант отбрасывали, осадок снова ресуспендировали в 10 мл среды с сывороткой, проводили повторное центрифугирование, после чего осадок ресуспендировали в 5 мл ростовой среды описанного состава с добавлением 10 нг/мл человеческого рекомбинантного основного фактора роста фибробластов (ФРФ_о) (CellGenix, Германия) и помещали в культуральный флакон площадью 25 см² («Corning», США), который инкубировали при 37^ºС в атмосфере с 5% углекислого газа в термостате (Sanyo MCO-15AC, Япония). Среду во флаконе меняли каждые 3-4 дня. По достижении клетками монослоя их пересевали используя трипсин («ПанЭко», РФ) или смесь трипсин/Версен («ПанЭко», РФ) по обычной схеме.

После 4 пассажей клетки подвергали криоконсервации: за сутки до нее заменяли культуральную среду, с помощью 0,25% раствора трипсина («ПанЭко», РФ) клетки снимали с подложки и переводили в ростовую среду с повышенным содержанием сыворотки (40% эмбриональной телячьей сыворотки («HyClon», США)). Полученную суспензию охлаждали до 4⁰С. Затем при тщательном перемешивании в нее добавляли диметилсульфоксид (Sigma, для замораживания клеток, США) до 10% общего объема. Полученную суспензию, содержащую примерно 1 млн клеток в мл, разливали по 1 мл в пробирки для криоконсервирования (Nunclon, Дания). Пробирки запаковывали в пенопластовые пеналы и на сутки помещали в кельвинатор с температурой -70⁰С. После этого пробирки переносили в специализированный сосуд Дьюара с жидким азотом.

Для индукции остеогенной дифференцировки клетки высаживали в культуральной среде без основного фактора роста фибробластов в чашки Петри («Corning», США) диаметром 3 см в плотности 20 000 клеток на 1 см². Через день клетки переводили в среду, следующего состава: среда DMEM, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 50 мкM аскорбат-2-фосфата, 10 мМ β-глицерофосфата и 0,1 мкМ дексаметазона (все реактивы Sigma, США). Среду меняли каждые 3-4 дня. Через три недели клетки промывали раствором фосфатно-солевого буфера (PM16, Serva, Германия) и фиксировали 3,7% раствором формальдегида на фосфатно-солевом буфере в течение 20 мин при комнатной температуре. Оценку активности щелочной фосфатазы (КФ 3.1.3.1) проводили по методу McGadey [9]. Способность экспрессированного матрикса к минерализации – проводили с помощью выявления кальция ализариновым красным [10] с измерением размеров костных узелков.

Культуры клеток наблюдали с помощью инвертированного фазово-контрастного микроскопа Diavert (Nikon, Япония). Фотографии делали цифровой камерой Nikon D70. Цифровое усиление контраста проводили с помощью программы Image J.

Сравнительный анализ культур МСК проводили с помощью визуального ранжирования по степени выраженности изучаемых признаков: способности образовывать минерализованный матрикс и активности ЩФ. При этом определение количества минерализованного матрикса, который выявляется окраской ализариновым красным, с нашей точки зрения является лучшей мерой оценки костеобразования, поскольку включает в себя измерение конечного продукта костной дифференцировки. Следует отметить, что процедура ранжирования, безусловно, несет отпечаток субъективности, однако мы полагаем, что другие стандартные способы количественного анализа костеобразования и активности ЩФ имеют более существенные недостатки. Так, в случаях активного костеобразования практически вся поверхность чашки интенсивно окрашивалась, и становилась непрозрачной, за счет чего оптическая плотность культуры не могла быть точно измерена. Кроме того, помимо собственно интенсивности окраски культуры информацию об остеогенезе несут костные узелки различного размера, трехмерная структура которых даже невооруженным глазом отчетливо видна на дне чашки. При сравнении любых двух чашек, практически всегда легко сказать какая из них имеет более развитую структуру образовавшегося минерализованного матрикса. Это позволяет распределить все чашки по возрастанию костеобразующей способности и составить упорядоченный ряд, присвоив им, соответственно, от 1 до 12 баллов.

С количественной оценкой активности ЩФ возникали аналогичные трудности. В ряде чашек клетки с очень высокой активностью ЩФ распределены крайне неравномерно, образуя компактные группы, окрашивающиеся практически в черный цвет. В этой ситуации простое измерение оптической плотности по чашке явно будет занижать активность ЩФ. Поэтому, как и в случае с оценкой костеобразовательной активности  проводили ранжирование всех чашек, сравнивая их попарно.                                   

Результаты и обсуждение

Анализ полученных результатов показал, что в культурах клеток всех пациентов после индукции остеогенной дифференцировки выявлялись признаки костеобразующей активности МСК, однако их проявления существенно различалась. Так, у молодых пациентов отложения минерализованного матрикса (костного эквивалента), как правило, были отчетливо выражены, и содержимое чашек хорошо прокрашивалось ализариновым красным. При микроскопическом исследовании были  видны многочисленные минеральные гранулы, а также расположенные с различной плотностью костные узелки размером от 10 до 500 мкм и более. У пациентов из старших возрастных групп культуры МСК обладали более слабой способностью формировать костные структуры, и отчетливое окрашивание большей части поверхности чашки не происходило. При этом минерализованные структуры матрикса были более рыхло упакованы, костные узелки встречались значительно реже, и обычно имели меньшие размеры.

Структурная организация костных узелков хорошо прослеживалась в ходе микроскопического исследования при темнопольном или смешанном освещении. При использовании светлого поля минерализованные структуры менее рельефны. Обычно отчетливо выявлялась несколько уплотненная центральная часть костных узелков, а также светлая кайма по их периметру, обусловленная отражением света от водной прослойки. По мере высыхания препарата ширина светлой каймы уменьшалась.

Анализ препаратов, окрашенных по McGadey, показал, что после индукции остеогенной дифференцировки в культурах клеток всех пациентов выявлялись МСК, обладающие активностью щелочной фосфатазы (ЩФ). Количество таких клеток и интенсивность их окраски  были значительно больше у молодых пациентов, в результате чего содержимое чашек прокрашивалось лучше, чем у пациентов старшего возраста . Кроме того, у молодых людей МСК с выраженной активностью щелочной фосфатазы чаще располагались плотными группами, соответствующими костным узелкам различного размера.

Сравнительный статистический анализ полученного материала показал, что в подавляющем большинстве случаев культуры МСК с более высокой активностью ЩФ, обладали и более высокой костеобразующей способностью. При этом была выявлена сильная положительная корреляция между костеобразующей способностью клеток и активностью ЩФ. Анализ зависимости костеобразующей способности от возраста пациентов установил наличие отчетливой обратной корреляции между ними.

Таким образом, проведенное исследование показало, что в культурах МСК из губчатой кости челюстей всех пациентов после индукции остеогенной дифференцировки в той или иной мере выявлялись признаки костеобразующей активности. Этот факт позволяет полагать, что МСК доноров всех возрастов обладают определенным остеогенным потенциалом. Снижение же костеобразующей способности МСК и, соответственно, уровня регенераторных потенций скелетных тканей в старческом возрасте по данным [6,11,12] обусловлено уменьшением содержания мультипотентных стволовых клеток, которые, как известно [6,13,14,15,16], сохраняют свою способность к дифференцировке по остеогенной линии вне зависимости от возраста донора.

   Полученные результаты соответствуют данным литературы [8,17] и дают основание считать, что при репарации костных дефектов клеточная терапия с использованием аутологичных прогениторных клеток применима для пациентов старших возрастных групп. Это имеет особое значение в стоматологии, так как среди пациентов, нуждающихся в восполнении утраченных костных структур челюстей, чаще всего встречаются лица пожилого и старческого возраста.  

 

 

ЛИТЕРАТУРА

1. Spector M. Basic principles of tissue engineering // Tissue Engineering.   Applications in maxillofacial surgtry and periodontics. – Quintessence Publishing Co, Inc. – 1999. – P. 3-16.
2. Bianco P., Robey P. Mesenchymal Stem Cell: clinical applications - J. Clin. Invest. - 2000, v.105, P.1663-68.
3. Fleming J.E., Cornell C.N., Muschler G.F. Bone cells and matrices in orthopedic tissue engineering // Orthop. Clin. North America., 2000, v.31, N.3, P.617-639.
4. Ohgushi H., Caplan A.I. Stem cell technology and bioceramics: from cell to gene engineering. J Biomed Mater Res. (Appl. Biomater.) 1999, 48: 913-927.
5. Kadiyala S., Jaiswal N., Bruder S.P. Culture-expanded, bone-marrow derived mesenchymal stem cells can regenerate a critical-sized segmental bone defect. Tiss. Eng., 1997; 3: 173-185.
6. Haynesworth SE, Goldberg VM, Caplan AI. Diminution of the number of mesenchymal stem cells as a cause for skeletal aging. In: Buckwalter JA, Goldberg VM, Woo SLY, editors. Musculoskeletal soft-tissue aging: Impact on mobility. Am Acad Ortho Surg; 1994. p. 79–87.
7. Inoue K, Ohgushi H, Yoshikawa T, Okumura M, Sempuku T, Tamai S, Dohi Y. The effect of aging on bone formation in porous hydroxyapatite. J Bone Min Res., 1997; 12: 989 –994.
8. Mendes S.C., Tibbe J.M., Veenhof M., Bakker K., Both S., Platenburg P.P., Oner S.C., de Bruijn J.D., van Blitterswijk C.A. Bone tissue engineered implants using human bone marrow stromal  cells: effect of culture conditions and donor age // Tiss Engineering., 2002, v.8, N.6, P.911-920.
   1. McGadey J. A tetrazolium method for non-specific alkaline phosphatase. Histochemie. 1970. v. 23, Р. 180-184.
   2. Methods & Techniques For Histologists and Immunohistochemists http://www.ihcworld.com/_protocols/special_stains/alizarin_red_s.htm).
   3. Tabuchi C, Simmons DJ, Fausto A, Russell JE, Binderman I, Avioli LV. Bone deficit in ovariectomized rats: functional contribution of the marrow stromal cell population and the effect of oral dihydrotachysterol treatment. J Clin Invest 1986; 78: 637– 642.
   4. Nakahara H, Goldberg VM, Caplan AI. Culture-expanded human periosteal-derived cells exhibit osteochondral potential in vivo. J. Orthoр. Res., 1991; 9: 465– 476.

 

1. Kitamura S., Ohgushi H., Hirose M., Funaoka H., Takakura Y., Ito H. Osteogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal cells cultured on alumina ceramics. Artificial Organs. 2004, 28(1): 72-82.
2. Jaiswal N, Haynesworth SE, Caplan AI, Bruder SP. Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro. J Cell Biochem., 1997; 64: 295–312.
3. Kotobuki N, Hirose M, Takakura Y, Ohgushi H. Cultured autologous human cells for hard tissue regeneration: preparation and characterization of mesenchymal stem cells from bone marrow. Artif Organs 2004; 28: 33–39.
4. Malchesky P.S. Editor-in-Chief’s Review. Artificial Organs 2004: A Year in Review. Artificial Organs 2005; 29(3): 268–284.
5. Murphy J.M., Dixon K., Beck S., Fabian D., Feldman A., Barry F. Reduced chondrogenic and adipogenic activity of mesenchymal stem cells from patients with advanced osteoarthritis // Arthritis Rheumatism., 2002, v.46, P.704-713.